鉴别商品种子品种的真伪和纯度，对于种子生产、经营和使用者控制种子的质量，从而保证农业生产产值是至关重要的。目前我国80%以上种子质量问题集中于品种真伪和纯度的鉴定。相关种子的育种专家需要通过田间栽培确定该批种子是否为本品种种子；生产中出现的问题是否属于气候环境条件、栽培方式或病害的影响。这种检测一般需要使用本品种的一个生长周期。甘蓝是我国主要蔬菜作物之一，生产上用种90%以上均为一代杂种，杂交品种的纯度(杂交率)对生产产生直接影响，国家对进入市场的甘蓝杂交品种纯度制定的标准是大于96%，目前，我国对甘蓝杂交品种进入市场前的纯度鉴定多采用田间鉴定方法，不仅占用土地资源，且费工，费时，需一个生长周期才能获得结果，而在我国大部分地区，甘蓝类的收种与播种期之间一般不到两个月，因此，甘蓝类的商品种子在进入市场之前往往无法进行及时的品种鉴别和纯度检测，使伪劣种子给农业生产造成严重危害的事件时有发生。EST-SSR分子标记技术在品种纯度鉴定上，较其它分子标记准确性高，重复性好，试剂成本低，本实验中用的是芸薹属的EST-SSR引物，省去了SSR测序的复杂程序，操作步骤简单，工作人员皆可操作，本研究通过EST-SSR分子标记在4个甘蓝杂交品种材料上的应用结果，为甘蓝杂交种纯度鉴定找到一种快速、稳定、准确、操作简单易行、经济高效的分子鉴定方法。

1结果和分析
1.1 EST-SSR引物的扩增
选择来自芸苔属的106对EST-SSR引物对4个甘蓝杂交种及其亲本进行扩增，其中90对引物对这四个甘蓝杂交组合都得到了稳定的扩增产物，只是多数引物对甘蓝样品扩增只扩增出一条带，杂交种和亲本都只有一条带，所以多数引物的扩增不能把杂交种和亲本区分开来，这也是因为甘蓝栽培种之间亲缘关系较近，形态特征相近。经过分析其扩增得到的指纹图谱，选出扩增带型稳定，重复性好，能将杂交种与其亲本鉴别开来的4对引物，详见表1。共检测出4个等位基因，每对引物可以检测到1个等位基因，片段大小为100~600 bp之间。EST-SSR扩增体系是与扩增芸苔属大白菜所用的扩增体系相同(李丽等, 2009)，结合高分辨率琼脂糖胶电泳技术，获得了清晰可见的EST-SSR指纹图谱(图1~5)。

图1 引物BG544066对春甘2号杂交种与其亲本扩增得到的EST-SSR指纹图谱

图2 引物272072对秋甘2号杂交种与其亲本扩增得到的EST-SSR指纹图谱

图3 引物CX272451对秋甘3号杂交种与其亲本扩增得到的EST-SSR指纹图谱

图4 引物CX272451紫甘2号杂交种与其亲本扩增得到的EST-SSR指纹图谱

图5 引物CX271723对春甘2号20个杂交种单株扩增得到的EST-SSR指纹图谱

1.2 EST-SSR指纹图谱分析
通过引物筛选、扩增和比较分析其扩增片段的大小，多数引物所扩增条带只有一条带，缺少多态性，不能将杂交种与其亲本区分开来。但试验中还是通过筛选得到了扩增出两条带的引物，极少发现能扩增得到3条以上的带的引物，扩增片段大小在100~600 bp之间。比较双亲和杂交种的扩增图谱，双亲和杂交种之间有几种类型：杂交种比双亲带多双亲的带稍弱，而杂交种的带增强，带型粗且色深(图2)；杂交种的带型与父本或母本一样；杂交种中同时具有父本和母本的带型，这种带型被称为互补型，杂交种的带型和亲本的带型清晰明亮，重复性好，三者之间能明确地鉴别开来(图1, 图3和图4)。经过筛选得到的这4对引物对甘蓝杂交种所扩增得到的带型即是这种带型。

1.3杂交种EST-SSR指纹图谱应用于杂交种纯度检测
在杂交种DNA电泳图谱的多种类型中，互补型条带是鉴定杂交种纯度最直观可靠的方法。通过分析所构建的指纹图谱，引物CX271723对春甘2号，引物CX272451对紫甘2号和秋甘3号杂交种与其亲本都扩增出互补带型，引物272072对秋甘2号杂交种与其亲本扩增得到的EST-SSR指纹可以鉴别出杂交种与亲本。根据以上EST-SSR标记的指纹分析，对一份春甘2号的商品种子进行扩增、分析其EST-SSR指纹，见图5所示，20粒春甘2号种子经扩增电泳结果显示，17株为真杂交种，3株为假杂交种(母本自交) (图5)。

2讨论
甘蓝杂交种与其它瓜果蔬菜品种一样，单利用有限的同工酶位点和蛋白质种类，远远满足不了其杂交种的纯度鉴定，不断育出的新品种中，困难在难以找到杂交种和亲本之间的鉴别带，将杂交种与亲本区分开来。EST-SSR分子标记的方法具有较其它DNA指纹无法比拟的优势，稳定重复性好，一步扩增操作简单，成本低经济实效，呈共显性遗传，易于分析，是一种适合用于杂交种纯度鉴定的方法，这已在西瓜(Joobeur et al., 2006; 田雷等, 2008, 种子世界, (5): 31-34)、甜瓜(Danin-Poleg et al., 2001)和白菜(Saal et al., 2001; Yu et al., 2009)等作物的杂交种纯度鉴定中和SSR标记的开发及应用于基因图谱定位的研究上得到证实。EST-SSR指纹图谱能否在甘蓝杂交种的纯度鉴定中得到实际应用，扩增体系的优化，EST-SSR引物的获得和能扩增出多态性带型的引物的筛选是问题的关键。本研究选择的逐步降低(touchdown)的退火温度(Szewc-McFadden et al., 1996)，这可以保证大小不同的引物都可以与模板配合选择到一个合适的退火温度形成DNA双链。每一对引物在扩增反应中的终浓度镁离子、4种脱氧核甘酸和DNA合成聚合酶的浓度经过大量试验的优化，得到了最佳浓度。本研究4个甘蓝杂交种和8个亲本为试验材料，筛选出了能够用于这四个杂交种纯度鉴定，并具有清晰鉴别带的引物，建立了适于EST-SSR指纹图谱检测甘蓝品种纯度的反应体系，试验研究结果表明通过EST建立SSR分子标记是一条利用分子标记于杂交种纯度鉴定的经济实效、极具发展潜力、有着广阔前景的一条途径。

在现代栽培育种方法基础上育出的甘蓝杂交种，其很多亲本材料本身遗传变异幅度小，杂交种与亲本之间的多态差异不易找到。甘蓝的基础研究工作亟待开展，目前可以供用的现成的SSR引物并不是很多，本研究中利用已经得到的芸苔属白菜类的EST-SSR引物，这既节省了引物序列的获得要经过大量基因测试过程中巨大的成本耗费，也验证了SSR引物在属内近缘种之间的通用性。选择来自芸苔属的106对EST-SSR引物对4个甘蓝杂交种及其亲本进行扩增，其中90对引物对这四个甘蓝杂交组合都得到了稳定的扩增产物，但是多数引物对甘蓝样品扩增只扩增出一条带，杂交种和亲本都只有一条带，所以多数引物的扩增不能把杂交种和亲本区分开来，这是否只是因为甘蓝栽培种之间亲缘关系较近，形态特征相近的原因，如果开发利用甘蓝的EST信息库设计SSR引物，是否能得到较高比率的稳定多态引物，这还需要做进一步的研究工作。

3材料和方法
3.1实验材料
本研究中所用到的12份甘蓝(Brassica oleracea)样品(包括秋甘2号、秋甘3号、春甘2号、紫甘2号4个杂交种和每个杂交种的父母本)由北京市蔬菜研究中心甘蓝育种课题提供。这4个甘蓝组合为优质甘蓝胞质雄性不育系列杂交品种大面积推广的杂交种，代表了春秋两季的不同栽培品种。样品材料为甘蓝种子。

3.2基因组DNA提取
取生长了30~40 d的单株幼苗的幼嫩真叶提取总DNA。DNA提取方法参照(李丽等, 2009)的SDS方法略加修改，将取样量由30~40 mg增加为50~80 mg。

3.3 EST-SSR引物来源
基于先前的大白菜EST-SSR引物开发研究(李丽等, 2009)，对十字花科芸薹属白菜类(Brassica rapa) EST信息库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)进行搜索，获得242对SSR引物序列。这些引物结球白菜(Brassica rapa ssp. pekinensis)材料的筛选，得到106对多态的引物(李丽等, 2009)。本研究中用12份甘蓝样品对具有多态的106对引物进行了筛选，得到4对引物可以将这4个杂交组合中的每一个杂交种与其亲本区分开来，序列见表1。

表1 可用于甘蓝杂交种纯度鉴定的EST-SSR引物

3.4 SSR反应体系及扩增程序
PCR反应体系同李丽等(2009)，反应体系为20 µL，其中加入10 mmol/L dNTP 0.2 µL, PCR反应体系中Mg²⁺的浓度为2.5 mmol/L引物取量20 mmol/L。扩增程序应用Szewc-McFadden等(1996)提出的TouchDown PCR 扩增程序并有少量修改，将扩增循环中的延伸时间由45 s延长为了75 s。

3.5电泳分析检测
扩增产物在含有5 mg/L GoodView的超高分辨率的琼脂糖凝胶(美国Amresco公司)上电泳，凝胶浓度为2.5%~3%。电泳仪采用北京六一厂生产的DYY-III型电泳仪，在5 V/cm的电压下，进行2.0~2.5 h电泳。使用Alpha Innotech公司MultimageTM凝胶成像仪进行凝胶扫描成像。

作者贡献
在此篇论文的完成过程中，简元才作者和丁云花作者提供了甘蓝杂交种组合实验材料和实验中的一些试剂；李秀清作者和马连平作者完成很多实验；李丽作者负责所有的实验设计和结果分析。

致谢
在此对大家的工作和所付出的辛勤努力一并表示感谢！并感谢两位匿名的同行评审人的评审意见和修改建议。

参考文献
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Joobeur T., Gusmini G., Zhang X., Levi A., Xu Y., Wehner T.C., Oliver M., and Dean R.A., 2006, Construction of a watermelon BAC library and identification of SSRs anchored to melon or Arabidopsis genomes, Theor. Appl. Genet., 112(8): 1553-1562 doi:10.1007/s00122-006-0258-6 PMid:16604337

Li L., He W.M., Ma L.P., Liu P.Y., Xu H.M., Xu J.B., and Zheng X.Y., 2009, Construction Chinese cabbage (Brassica rapa L.) core collection and its EST-SSR fingerprint database by EST-SSR molecular markers, Jiyinzuxue Yu Yingyong Shengwuxue (Genomics and Applied Biology), 28(1): 76-88 (李丽, 何伟明, 马连平, 刘庞源, 徐海明, 徐家柄, 郑晓鹰, 2009, 用EST-SSR分子标记技术构建大白菜核心种质及其指纹图谱库, 基因组学与应用生物学, 28(1): 76-88)

Szewc-McFadden A.K., Kresovich S., Bliek S.M., Mitchellc S.E., and McFerson J.R., 1996, Identification of polymorphic conserved simple sequence repeats (SSRs) in cultivated Brassica species, Theor. Appl. Genet., 93(4): 534-538 doi:10.1007/BF00417944

Saal B., Plieske J., Hu J., Quiros C.F., and Struss D., 2001, Microsatellite markers for genome analysis in Brassica. II. Assignment of rapeseed microsatellites to the A and C genomes and genetic mapping in Brassica oleracea L., Theor. Appl. Genet., 102(5): 695-699 doi:10.1007/s001220051699

Yu S.C., Zhang F.L., Yu R.B., Zou Y.M., Qi J.N., Zhao X.Y., Yu Y.J., Zhang D.S., and Li L., 2009, Genetic mapping and localization of a major QTL for seedling resistance to downy mildew in Chinese cabbage (Brassica rapa ssp. pekinensis), Molecular Breeding, 23(4): 573-590 doi:10.1007/s11032-009-9257-z